余武秀 编译 上海艾农国际贸易有限公司
本文是一篇由来自南非基因工程和生物技术国际中心生物农药组,尼日利亚埃多大学微生物学系微生物学、生物技术和纳米技术实验室,尼日利亚国家根类作物研究所,南非农业研究委员会-植物健康和保护、杂草生理组,印度喀拉拉邦中心大学地球科学系统学院环境科学系,印度莱亚普尔卡尔萨学院生物技术系,波兰格坦斯克大学重组疫苗系,尼日利亚阿布贾大学农学院植物保护系,印度卡纳塔克大学植物学系的多位专家联合撰写的评论文章。深刻剖析了生物农药研究和开发中存在的各种问题并针对性地提出了中肯的建议。
1. 引言
多年来,农药对提高农业生产率和农民收入都做出了巨大贡献,尽管如此,人们对一些农药产品的安全性一直存在担忧。日益严格的农产品农药残留规定,也反映了人们对高质量和安全食品的需求在不断增长。生物农药与传统的化学合成农药相比,通常其毒性更低,一般只影响目标害虫及其密切相关的有机体,往往用量相对较少,分解更快,从而其暴露更少。
在过去的几年里,生物农药作为一种更安全的害物防治方法被并入到有害生物综合治理项目中,引起了全球的关注。在过去十年,IPM方案的采用大大提高了有害生物管理的效率,减少了农药的使用,从而减少了对化学合成农药的需求。近年来,随着法规越来越严格,一些农药产品被淘汰出局,新的化学合成农药的开发大幅下降,导致可供选择的化学农药更加有限,故生物农药成为更可行的选择。许多国家还不断降低进口农产品的农药最大残留限量,越来越有必要探索有害生物防治方法的多元性,以减少对化学合成农药的依赖。
本文以近期由全球生物农药从业者参加的国际研讨会为基础,寻求广泛的利益相关方的参与,共同评估应对生物农药研发的挑战的方案,并通过对非洲草地贪夜蛾的案例研究,详细介绍了生物农药的应用前景。
2. 生物农药市场
目前,生物农药仅占全球作物保护市场的一小部分(5-6%),价值介于30亿美元和40亿美元之间。这在一定程度上得益于许多国家和地区努力实施法规,采用环保产品用于农业生产。最近报道了一些有前景的产品,如蝶豆植株提取物,木霉菌产品,黄蓝状菌菌种,氧化苦参碱,干酪乳杆菌菌株LPT-111的发酵产物, 苏云金芽孢杆菌黄粉虫变种的菌株Xd3 (Btt-Xd3)产品,橄榄油厂副产物, 从葡萄藤提取物中分离得到二苯乙烯类等。虽然这些物质很有潜力,但在不同的种植体系中,它们对特定害物的作用仍然不清晰。
因更强的环保和健康意识、可持续发展、监管压力和零售商的需求等多方因素推动,生物农药的市场正在迅速扩大。过去,生物农药只由当地或地区的小公司生产,这些公司在严格的法规流程中挣扎,无法扩大市场份额；目前,大型跨国农化公司正在这一领域大力投资,因此,预计持续增长的生物农药市场将在未来20-30年里在市场规模上赶上化学农药。然而,采用率的不确定性,特别是在发展中国家,可能会影响此预估。
3. 开发和商业化生物农药的前景和挑战：监管、研究、政策和产业
生物农药的定义和分类以及生物农药法规的严格程度在不同的国家、地区、监管机构甚至科学界都有所不同。例如,美国环保署认可了植物组合剂,即将转移到植物体内的基因(如Bt基因)所产生的杀虫物质作为生物农药。另一方面,在欧盟,“生物控制剂”一词被用来代替“生物农药”一词；而PIPs不被认为是生物农药。这些差异使得企业很难应对监管过程,包括Arora(2016)和Balog等人(2017)在内的几篇评论文章已经讨论过这些差异。尽管有许多生物活性物质已经被分离和制剂化了,但由于许多国家冗长而官僚的监管程序,很少有能完成登记。目前除了在美国等少数国家之外,生物农药的监管过程往往是类似于化学农药的,并没有专门制定适合生物农药的监管模式。
风险评估是生物农药登记的关键要求。然而,尽管这种评估应通过以科学证据为基础的程序进行,但在一些国家提交报告的程序比较冗长。因此,需要修改登记要求,以促进对生物农药活性物质的有效评估。阻碍生物农药登记的另一个因素是新药剂登记的高成本。建议监管部门根据合理和适当的规定,加快生物农药产品的登记程序,使新产品能够快速进入市场,从而产生收入。
许多研究通常是在生物农药开发的早期阶段进行的,从而产生了大量关于“潜在的”生物农药的文章。有人建议,这些物质应该被称为生物控制剂,只有被批准用于商业用途后才被标注为生物农药。
从研究项目到产品实现的转变需要各个领域的专业知识。有必要对生物农药研究进行协调,从而形成“生物农药创新链”和/或集中研究、开发和提供生物农药。
生物农药的发展,正如其他所有的研究和开发工作一样,需要有技能的人力,充足的基础设施,与一个或多个中小企业协作,在研究的早期阶段和整个开发过程提供投入,确保开发的产品的商业化潜力。还需要与农药工业以外的配套部门加强互动。像大公司那样,为创新申请专利以获得收益,对小公司而言也是非常重要。自然存在的有机体不可能申请专利,但是专利法能够区分发现和发明,而发明只要符合《与贸易有关的知识产权》(TRIPS)第27条规定的可专利性标准(新颖性、发明步骤和工业适用性)就可以申请专利保护。从消费者的角度来看,与生物农药使用相关的主要挑战是需要加强管理和接受其药效比化学农药的略差。
简而言之,未来生物农药的开发需要各学科之间更广泛的协作,并确保行业投入从研发物质的早期筛选、研发过程,直到确定最合适的商业和融资模式。
4. 利用病毒生物农药的机会--现状和未来
已知有几种病毒可以感染昆虫,但只有杆状病毒科(一种高度专化的病毒)的病毒被开发出来用于防治害虫。这是因为它们具有良好的安全性和高特异性。然而,直到最近,由于其缓慢的杀虫作用和商业化离体生产的技术困难,它们作为生物农药的应用一直受到限制,这个情况因巴西农业研究公司的弗拉维奥博士的巨大努力,得以改变。如今,许多国家都增加了受杆状病毒保护的作物面积,如印度、中国、巴西和南非等。巴西于1980年代初引进了一项控制大豆夜蛾的方案,在2003/2004年的季节,用核多角体病毒防治大豆夜蛾的面积约200万公顷。目前,巴西的大豆、玉米和棉花田受到棉铃虫核多角体病毒的保护,免受棉铃虫的侵害,面积约130万公顷,而大面积的木薯田则喷洒了木薯天蛾颗粒体病毒的制剂。
以下两种旨在扩大杆状病毒生物农药的应用的方案将在未来实施：一是在限制使用转基因生物的国家,将主要是在诊断水平、离体生产和改变生物农药配方等方面予以改进；二是通过对杆状病毒基因组与另一自然病原体的基因进行基因修饰,以增强杆状病毒的杀虫活性。
5. 植物源农药--研究现状与展望
植物源农药是指用于防御各种害虫的源于植物的有机农药。其通过驱避、抗取食、抗保幼激素活性、产卵/孵化威慑、抗生育或生长中断等机制来控制害虫。这些生物农药对真菌、病毒和细菌也有效。以抗保幼激素活性为例：从洋甘菊精油中提取的抗保幼激素,它干扰昆虫分泌保幼激素的腺体的功能,从而在蜕皮阶段抑制了昆虫的生长。拒食剂的作用机理主要是针对昆虫的味觉细胞,或者通过刺激味觉感受器,或者阻止进食刺激物,还有被认为会引起神经系统不稳定的电脉冲,干扰了昆虫的进食。植物制剂作为杀虫剂的使用效率通常不高,因此在非洲野外使用的程度有限。因此,有必要优化它们的药效,并生成相关的药效和安全方面的数据。
植物源农药研发的一个关键挑战是,植物的粗提取物是属于不同化学类别的化学分子的混合物,所有这些化学分子可能都不具有生物活性,因此,要使植物源农药有效,必须有化学标准化过程来识别和浓缩具有活性成分的化学分子。从积极的方面来说,植物源农药在几天甚至几个小时内就会降解得很快,所以大多数植物源农药对环境是安全的。但是,也正因此,它们的施用次数会增加,使用成本也更高。
简而言之,由于诸多障碍,只有很少的植物源农药被商业化,这些障碍包括：大规模生产的植物材料短缺,标准化化学复合物提取比较困难,监管部门的要求严格,植物农药的药效缓慢,缺乏残留数据,以及市场上有很多更具成本优势的竞争产品。然而,鉴于一些合成农药的负面影响,有必要解决这些挑战,使植物源农药的制剂能够商业化并进入市场。
6. 生物除草剂的生产和田间应用的限制
杂草对作物的严重影响威胁着全球粮食供应和农业经济。这些杂草主要是通过施用化学除草剂来控制的。然而,化学除草剂的过度使用、施用和管理不当,造成环境污染,对包括人类在内的非目标生物造成危害。
为此,研究人员已经开发出生物除草剂,即从活的生物体中提取的除草剂。风险更低,在环境中的持久性也更短。此外,它们有多种作用模式,可以降低杂草抗性发展的风险。目前,只有一些生物除草剂已在市场上获得成功,这可归因于一些挑战,包括有限的宿主特异性、不正确的配方和缺乏田间持效性等。要使生物除草剂成为重要的除草剂,需要采取扩大寄主范围、改进配方和田间持效性、增强除草特性和采用先进技术等策略。
用于控制杂草的真菌被称为真菌除草剂。许多真菌可以作为植物病原体和未来的生物防治剂,但只有很少一部分被商业化了。在细菌中,野油菜黄单胞菌和荧光假单胞菌显示出作为生物防治剂的潜力。烟草花叶病毒等也被研究用作生物除草剂。在世界上大约有24种基于微生物的生物除草剂已被注册为商业用途,还有其他尚处于评估阶段的微生物种类将作为商业产品进行登记注册和开发。
在生物除草剂的开发过程中,由于大多数的产品都具有宿主特异性,所以宿主的范围是一个复杂的问题。由于植物系统发育与病原菌特异性之间的关系缺乏明确的证据,宿主范围试验中微生物种类的选择比较困难。
生物除草剂微生物定植对植株产生的风险,需要在选择生物除草剂之前对其进行评估；由于潜在的定植在自然中发生,妨碍了其商业化的可能性。微生物之间对营养、空间的竞争和拮抗作用可能减少微生物的数量,植物滤液中的有毒物质可能对生物除草剂的药效产生负面影响。
环境条件在决定生物除草剂的药效方面也起着重要作用,如初始侵染、侵染扩展和扩散到杂草的速度等,目标杂草的二次感染率也会受最佳环境因素控制。生物除草剂的商业化开发主要取决于大规模生产一种活的、致病的和遗传稳定的繁殖体(如微生物孢子、碎片或颗粒)的可行性。需要具体的技术和政策手段,使生物除草剂既经济又能受农民欢迎。研究人员应该考虑克服生物除草剂发病机理的生物学和环境限制的重要性,使它们成为有潜力的商业产品。
7. 生物农药应用前景--微生物和植物制剂防治非洲草地贪夜蛾的案例研究
草地贪夜蛾是一种原产于美洲的极具侵略性的鳞翅目害虫,偏爱玉米,也以其他80多种作物为食,包括水稻、高粱、小米、甘蔗、蔬菜作物和棉花等。2016年在非洲首次被报道,2018年传播到亚洲。草地贪夜蛾对至少16种昆虫病原敏感,包括病毒(核多角体病毒)、真菌(包括绿僵菌、绿僵菌和白僵菌)、原生动物、线虫和细菌(苏云金芽孢杆菌)等。这些病原体中有许多是在草地贪夜蛾种群中自然产生的,其中真菌、病毒和细菌最为常见,是草地贪夜蛾种群的重要的自然控制因子。在非洲,它们会在野外杀死草地贪夜蛾的幼虫。生物农药中,病毒(核型多角体)、细菌(苏云金芽孢杆菌)、真菌(绿僵菌和白僵菌)以及植物源杀虫剂(印楝素)都显示出了防治草地贪夜蛾的潜力,应被进一步研究。还有昆虫病原线虫已被证明可以作为生物防治策略,如异小杆线虫,印度小杆线虫和小卷蛾斯氏线虫,也可防治草地贪夜蛾。
以病毒为基础的杀虫剂具有高度的特异性、毒性,对脊椎动物无毒,有开发为生物农药的巨大潜力。杆状病毒在生态系统中控制各种昆虫的数量方面,往往发挥着重要作用。Sihler等人研究了草地贪夜蛾颗粒病毒和核型多角体病毒在草地贪夜蛾防治中的应用。研究表明,颗粒病毒显示出更大的潜力。然而,颗粒病毒自身的作用速度较慢,Cuartas等人指出,将它们添加到SfMNPV配方中可能会改善核型多角体病毒的性能。害虫是通过摄入受污染的植物材料而经口感染的。感染了NPV的幼虫会出现斑点、皮肤变黄等症状,食量比健康幼虫的低10%。受杆状病毒感染的幼虫通常向光移动,因此经常在植物顶部发现。死后,它们通常被发现挂在植物上,头朝下。死亡的幼虫变得柔软,最终渗出类病毒颗粒和液体,这有助于进一步传播病毒。影响病毒效力和杀灭速度的关键因素有：草地贪夜蛾幼虫的年龄、摄取病毒的量、病毒的毒性、当时的气候条件即温度、湿度和太阳辐射(紫外线)、使用的配方、喷洒的时间和使用的设备类型等。因此,除其他外,有必要进行研究,以确定这些生物农药的最适当的配方和应用方法。Li等证明在杆状病毒制剂中添加紫外线增白剂可改善其性能。
昆虫病原真菌是大多数生态系统的重要和广泛的组成部分。真菌在昆虫种群中通常是一个重要的自然死亡因素。尽管约有90属的700多种真菌对昆虫具有致病性,但只有少数真菌在农业害虫管理方面得到了充分的研究。真菌的一个优点是,大多数菌种都是专性病原体,因此具有特异性。另有一些菌种,如曲霉和镰刀菌,是兼性的多型病原体。EPFs通常会在自然条件下引起动物流行病,故可以从广泛的宿主中分离和鉴定本土真菌分离物。真菌孢子通过昆虫的体毛进入昆虫体内并在昆虫体内繁殖,从而破坏昆虫的组织,产生毒素,导致宿主死亡。病虫停止进食,变色,死亡后常出现变硬和钙化,同时真菌生长旺盛。球孢白僵菌、绿僵菌和莱氏蛾霉是常见的真菌,具有开发成生物农药的潜力。球孢白僵菌已被用于防治草地贪夜蛾,不过它的致死率中等。研究表明,与其他鳞翅目害虫相比,草地贪夜蛾幼虫对球孢白僵菌的敏感度最低。国际昆虫生理学和生态学中心进行了一些研究,测试了三种不同属(绿僵菌属、白僵菌属和伊氏菌属)的真菌分离物对草地贪夜蛾二龄幼虫的活性,然而,试验结果并不是很理想。因此,有必要鉴定和加工其他有活性的防治草地贪夜蛾的昆虫病原菌。
苏云金芽孢杆菌是一种常见的居于土壤的、产生芽孢的革兰氏阳性细菌,可生成晶体毒蛋白,是目前应用于害虫防治的最为广泛的微生物农药。不同种类的昆虫对各种毒素的敏感性各不相同。尽管市面上有几款用于防治鳞翅目害虫的Bt产品,但它们对草地贪夜蛾的防治药效仍不明确。实验室研究表明,在不同的Bt菌株中,草地贪夜蛾对鲇泽亚种和苏云金亚种更敏感。虽然库斯塔克亚种对多种鳞翅目害虫有效,对草地贪夜蛾却效果甚微。不同的研究小组目前正致力于筛选针对草地贪夜蛾的有效Bt菌株。草地贪夜蛾种群可能对不同的Cry毒素具有不同的敏感性,因此,这将影响不同地区草地贪夜蛾防治中基于Bt的生物农药的选择。除Cry毒素外,草地贪夜蛾还易受Bt培养基中发现的多种营养杀虫蛋白的影响。商业化的Bt生物农药,特别是以鲇泽亚种菌株为基础的Bt生物农药已经在非洲注册,并在一定范围内可用。已建议进行评估这些生物农药对非洲草地贪夜蛾的有效性的研究。
昆虫病原线虫在控制对人类、动物和环境安全的土壤害虫方面可以作为化学合成农药的替代品,因此被广泛应用于园艺行业。草地贪夜蛾也被证明对这些有益线虫高度敏感,特别是对小卷蛾斯氏线虫和Steinernema riobravis。然而,线虫的挑战在于,它们需要在非常特定的时间使用,通常是在清晨或深夜,此时草地贪夜蛾幼虫非常活跃,很容易被线虫发现。这些窗口期还有助于将线虫暴露在紫外线下的时间降到最低,否则它们会被紫外线杀死。
EPNs的一个优点是,它们可以在不稀释其浓度或不影响其生存能力的情况下喷射,与产生电荷的设备喷雾混合,也可以用那些使用液压和旋转喷嘴的设备喷雾。实验室研究表明,有几种与三种EPNs兼容的商用杀虫剂,包括印度小杆线虫、小卷蛾斯氏线虫及昆虫病原格式线虫。事实上,一些研究表明,当线虫与杀虫剂混合时,其效果会得到增强,例如, 印度小杆线虫与虱螨脲复配可提高对草地贪夜蛾的疗效。
但是,有必要全面评估杀虫剂和EPNs的相容性,以作为开发防治非洲草地贪夜蛾IPM项目的一部分。尽管在非洲开发控制草地贪夜蛾的EPNs具有很大的潜力,但迄今为止只有几个国家进行了调查。例如,在埃及已经进行了一些有前景的研究,调查了在一些种植系统中将EPNs纳入IPM项目的潜力。在南非用EPNs防治甘蔗杆螟虫的研究只取得了有限的成功,归因于这样一个事实：这些害虫十分神秘,出没的地点通常是充满了大量的蛀屑和蛀痕。在控制草地贪夜蛾中应用EPNs也可能会面临这样的挑战。虽然在非洲尚未开发出商业化的产品,但有必要对EPNs进行广泛的研究,并探索其作为生物农药和IPM项目组成的潜力。
目前已知几种植物具有杀虫性能,并具有巨大的开发为防治草地贪夜蛾的植物农药的潜力。其中一些已经在世界其他地方的草地贪夜蛾的防治中被使用。大多数植物杀虫剂是可生物降解的,对人类和动物(包括天敌)是安全的,因此可以在IPM项目中作为生物农药使用。有几种植物提取物具有杀虫特性,可以防治非洲谷物的茎螟虫,如金合欢,辣椒,菊花,西非山毛豆,麻疯树,柠檬草,印楝,洋葱,波斯丁香,除虫菊,烟草,西非胡椒,野生万寿菊,野生鼠尾草和野生向日葵。
需要评估这些植物制剂对草地贪夜蛾的药效,并在该地区的农民中推广有效的植物制剂。
8. 生物农药生产与加工的发展现状
利用纳米技术和微胶囊技术可以提高生物农药产品的稳定性、持效性和有效性。纳米技术是研究纳米尺寸(1-100纳米)的材料,即纳米颗粒,具有独特和新颖的物理、化学和生物特性。这些NPs具有灵活的物理特性,表面积与体积比大,对蛋白质有很强的亲和力。通过微胶囊工艺将固体、液体和气体物质封装成1-1000摩尔/升的微粒子,广泛应用于医药、食品、化妆品和先进材料等领域。微封装确保了核心材料被完全包裹和隔离,从而免受外部环境的影响。因此,纳米生物技术的产品可以在作用部位控制释放分子,从而最大限度地减少对非目标生物的潜在毒性影响,并防止微生物降解活性剂。基于此,纳米技术产品将降低毒性,增强功效,并减少由于物理降解造成的损失。例如,纳米颗粒的使用可以有效地保护印楝素不被迅速降解,从而对目标害虫产生长期影响。
此外,从印楝种子中提取的印楝素的纳米乳液显著降低了贮藏害虫巴西豆象,从而表明其缓释的生物活性。也有报道称,各种纳米粒子可以包裹和保护含有活性成分的次生代谢物,这些活性成分有生物农药的作用。微囊化的草地贪夜蛾核多角体病毒粒子保护病毒免受紫外线灭活,展示出其作为生物农药的发展潜力。
因此,纳米技术将有助于开发具有良好安全性的低毒生物农药,提高活性成分的稳定性,增强其对靶标害虫的活性,从而促进农民的采用。然而,使用纳米颗粒的一些潜在风险因子需要通过相关的研究加以解决,其他需要解决的问题包括从纳米颗粒系统释放活性分子的速度、存储稳定性和该技术的成本效益等。
9. 结论与未来展望
目前已经分离鉴定了一些有潜力的、可进一步发展为生物农药的产品,有必要对其进行进一步的研究,以确保之前的努力不是徒劳。在研究新产品的同时,也需要研究克服那些影响某些产品药效的障碍。利益相关者之间的合作仍然是至关重要的,生物农药研究人员必须与工业、农民、决策者、政府和其他相关利益相关方密切合作。确保生物农药与现有农业系统相结合的方法也是必要的：众所周知,生物农药不能完全替代化学杀虫剂,因此,如何将生物农药有效地整合到害虫综合治理战略中,也应该成为努力和研究的重点。
同样重要的是,生物农药的使用成本必须确保其使用者有利可图,特别给发展中国家的农民使用。有必要让不知情的农民,特别是发展中国家的农民了解生物农药是缓解一些合成农药的大部分负面影响的可持续方案,并让他们了解这个的重要意义。促进生物农药登记注册的法规也可以促进其商业化和市场供应。虽然有几种新物质具有防治害虫的潜力,但需要进行更多的田间研究,以评估其在特定种植系统中的药效。
纳米技术等新技术在提高生物农药的药效和持效期方面显示了巨大的潜力,应该进一步探索它们的潜力。发展中国家的大多数研究所在知识产权管理方面缺乏最基础的能力。公共研究机构需结合法律、商业和技术知识,制定其独立的知识产权政策和有效的管理。