RNAi指的是将与目标mRNA对应的正义RNA和反义RNA组成的dsRNA导入细胞,促使mRNA发生特异性的降解,阻碍其在细胞中的进一步翻译,导致mRNA相对应的基因发生沉默的过程。经过广泛的研究发现,RNAi在昆虫中主要涉及siRNA、miRNA和piRNA三种机制[8]。

昆虫对RNAi的作用机制主要可分为细胞自主作用和非细胞自主作用两类。在细胞自主的情况下,基因沉默仅在引入dsRNA的组织中可见,RNAi的效率也有限；在非细胞自主RNAi的情况下,在dsRNA吸收位点以外的位置也可以观察到基因沉默的效果。在昆虫中,科研人员广泛研究了非细胞自主RNAi作用,当dsRNA从肠腔被吸收到肠细胞中就可以发挥RNAi沉默作用,此后dsRNA在肠道外细胞中的表达实现了沉默信号的传播。

基于dsRNA极易引入昆虫细胞,从而特异性实现RNAi目标,RNAi技术展现出作为生物农药的巨大潜力。dsRNA可以通过喷洒到受感染的农作物上从而特异性引入昆虫中,这项技术可视为杀虫剂使用的替代品,并因其避免了传统农药对环境的破坏而广受欢迎。2023年9月29号,美国EPA拟建议批准Greenlight Bioscience公司防治科罗拉多马铃薯甲虫的产品Ledprona,获批后,这将是全球第一款直接喷施使用的RNA生物农药。

RNAi生物农药的dsRNA递送策略[9]

此外,在一项将番茄植物根系浸入含有dsRNA溶液的实验中,观察到番茄潜叶蛾(Tuta absoluta)有80%的死亡率,这意味着植物韧皮部有效吸收了dsRNA[10]。另外广泛开展的技术包括使用纳米颗粒作为dsRNA穿过昆虫肠道上皮的载体、利用特异性细菌、病毒来诱导昆虫的基因沉默及通过农杆菌转化技术(Agrobacterium-mediated transformation)开发的具有杀虫作用的转基因植物等,如拜耳公司的第一款表达昆虫dsRNA的抗虫转基因玉米于2017年获得美国环境保护署(EPA)的种植许可,2021年获得中国农业部转基因安全许可证书。

由上可见,RNA生物农药具有危害低、可天然降解、普适性强等优点,被誉为继化学农药和转基因农作物之后的第三次生物农药革命。2024第二届合成生物学产业嘉年华暨展览会(SBC2024)将如期举行并特设″农业和畜牧业″专题论坛。会前,佰傲谷《佰家言》有幸采访到植生优谷董事长苗雪霞研究员,与她探讨RNAi技术运用于农业病虫害防控的发展状况及合成生物学在农业领域的广阔前景和未来趋势,以下为采访摘录。

生物农药已被证明是绿色低毒环保的新型农药

1、RNAi生物农药被称为农药史上的第三次革命,您能否简单介绍下RNAi生物农药的特点和发展现状？

苗雪霞：RNAi技术进行病虫害防治具有防治目标的专一性、靶标开发的便捷性、应用方便易于操作、绿色无污染、无残留及环境兼容性强等众多优势,完全符合公众对于绿色农药的需求,因此被称为农药史上的第三次革命。

在RNA生物农药研发领域,目前国外已经有产品上市或准备上市。拜耳公司的第一款表达昆虫dsRNA的抗虫转基因玉米于2017年获得美国环境保护署(EPA)的种植许可,2021年获得中国农业部转基因安全许可证书,截止到2023年12月,已有5款这一类型的产品获得授权；针对于直接喷洒使用的RNA生物农药,2023年9月29号,美国EPA拟建议批准Greenlight Bioscience公司防治科罗拉多马铃薯甲虫的产品Ledprona,获批后,这将是全球第一款直接喷施使用的RNA生物农药。

2、我们知道RNAi生物农药有宿主诱导基因沉默(Host-induced gene silencing,HIGS)、喷雾诱导基因沉默(Spraying-induced gene silencing,SIGS)或病毒诱导基因沉默(Virus/bacterium-mediated gene silencing,VIGS)等方式,其实也跟如何施药和进入病虫体内相关,在具体应用过程中您觉得这些方法各自的优缺点或者适用范围有哪些区别？

苗雪霞：针对于HIGS,孟山都公司(现拜耳)的第一款表达昆虫dsRNA的抗虫转基因玉米Mon87411即是属于该类型。该产品在玉米中同时表达了Bt蛋白,耐除草剂基因,以及针对玉米根萤叶甲Snf7基因的dssnf7。也就是通过转基因的方式,将昆虫的dsRNA在植物中表达,昆虫取食植物后,dsRNA即能够传递到昆虫体内发挥作用。

Greenlight Bioscience公司的防治科罗拉多马铃薯甲虫的产品Ledprona采用的是SIGS这种方式。dsRNA直接喷洒在有害虫危害的植物上,一方面,部分喷洒在昆虫上的dsRNA通过体壁渗透的方式进入昆虫体内；另一方面,昆虫取食喷洒有dsRNA的植物后,dsRNA进入到昆虫的体内并发挥作用。我们公司目前开发的RNA生物农药属于该类型。

病毒诱导的基因沉默(virus induced gene silencing,VIGS)是指携带目标基因片段的病毒侵染植物后,可诱导植物内源基因沉默、引起表型变化,进而根据表型变异研究目标基因的功能。该技术可以用来开发dsRNA 表达和生产系统,在植物体内和体外生产dsRNA,从而发挥作物病虫害防治的作用。

3、基于目前的田间试验结果,RNAi生物农药的安全性如何？包括健康毒理、生态毒理、环境归趋等风险评估情况。

苗雪霞：RNAi生物农药的核心成分是核酸,在环境中易降解成核苷酸,并能够作为原料被生物体利用,因此具有较高的生物安全性。 美国EPA披露的ledprona登记数据中,人类健康、环境归趋以及生态毒理数据均显示RNA生物农药是环境友好的农药。

我们公司研发的RNA生物农药针对于意大利蜜蜂、斑马鱼、日本沼虾的经口急性经口毒性测试表明,该农药符合国家标准定义的低毒,因此,可以说RNA生物农药是一款绿色低毒环保型的新型农药。

4、与传统农药相比,RNAi生物农药在价格及使用上有优势或者门槛吗？

苗雪霞：RNA生物农药的核心有效成分是dsRNA,其生产成本已经降低至1美元/g(Greenlight Bioscience公司数据),我们公司的dsRNA生产成本也已经降至每克几十元人民币,并且还有很大的优化和降幅空间。届时,RNA生物农药将和传统农药的价格相当甚至更低。

植生优谷已构建RNA生物农药全链条研发及生产体系

5、我们知道植生优谷建立了RNA生物农药全周期开发体系,您从技术的角度跟我们谈谈公司是如何解决RNA生物农药的脱靶、作用较慢、易降解、产生抗性等问题的？

苗雪霞：针对于RNA生物农药的脱靶问题,我们会在选择靶标基因之前,通过生物信息学的方法,预测可能的脱靶效应,避免选择可能脱靶的靶标基因。

关于RNA生物农药发挥作用较慢的问题,不同靶标基因对靶标物种的作用速度不同。某些靶标基因能够在较短的时间内发挥较好的基因抑制作用,也能够在较短的时间内对害虫产生致死作用,从而产生比较理想的防治。因此,靶标基因的选择也是非常关键的。

针对于dsRNA容易降解的问题,可以选择不同的材料对dsRNA进行修饰或者包埋。比如一些纳米材料,具有保护和稳定dsRNA的作用。我们公司基于离子配位螯合技术开发的一种制剂,对dsRNA也有很好的保护作用。不论是在环境中,还是在昆虫的肠道内,都能对dsRNA起到很好的保护作用,可有效减缓dsRNA的降解。

图源：植生优谷官网

害虫对人类开发的任何一种农药都会产生抗药性,只是迟早的问题,我们能做的是尽量避免或延缓抗性的产生。例如,昆虫中有很多基因,都可以作为RNA生物农药的潜在靶点,我们可以通过更换靶点、或者是在使用早期通过与其他绿色农药进行混配,延缓并防治害虫抗药性的产生。

6、近期,由于ChatGPT火爆出圈,AI制药又一次引发了人们的高度关注。据了解,植生优谷建立了从基于AI智能算法的大规模靶标基因筛选平台,能跟我们分享下AI如何促进公司技术研发进程的吗？

苗雪霞：AI 技术是未来科技竞争中的核心竞争力,我们经过多年研究与数据归集,初步建立了AI智能化筛选体系,这一系统可以实现快速高效的靶标基因筛选,能够更快更准确地预测潜在的靶标基因,这为RNAi在农业害虫中的应用提供了方便。我们知道,农业害虫中存在大量的未知基因,在现阶段还不太可能获得所有物种基因组信息的情况下,利用AI技术,可以有效节约研发成本和研发周期,节约更多的人力和物力资源。

7、植生优谷获得了5张农药″中文通用名″命名函,也在河南新乡开展了田间试验,目前公司的生物农药的研发进展如何？

苗雪霞：由于RNA生物农药在国内尚无许可上市的先例,想要实现产品最终落地,还有很多工作要做,前期我们与沈阳化工研究院以及农药命名委员会专家通过多次论证,最终在命名规则方面与命名委员会达成共识,建立了标准化的RNA生物农药命名规则,目前,我们正在积极推动RNA生物农药的登记备案工作。

RNA生物农药在3-5年内将有质的飞跃

8、从产业化的角度,您觉得目前RNAi农药的挑战还有哪些？

苗雪霞：RNA生物农药目前存在的最大挑战是核心成分dsRNA 的规模化生产以及制剂配方的标准化体系建立。此外,在政策层面上,目前还没有针对性的法律法规,这也是导致国内资本对这一领域不够热情的重要因素。

因此,想要解决这些问题,需要从国家层面上进行合规认定,加大资本投入,传统农药企业也应该看到,随着农药产品的逐步更新换代,农药产品的格局必将改变,RNA生物农药无疑是我国在生物农药领域实现赶超国际农化巨头的一次机会。

9、已有ledprona针对科罗拉多马铃薯甲虫的成功案例在前,您认为国内的第一个RNAi生物农药大概在什么时候能到来？

苗雪霞：我国有很多科研人员从事RNA生物农药相关的基础研究,我们公司也在积极进行RNA生物农药的开发,并取得了一定的成果,国家以及地方政府也有大量的项目支持RNA生物农药研发,相关部门也在广泛征求RNA生物农药登记的相关建议,相信在未来3~5年,中国的RNA生物农药将会有一个质的飞跃。

10、RNA技术除了生物农药,还有哪些运用方向？

苗雪霞：RNAi技术可以作为一种工具进行基因功能研究,通过将dsRNA递送进入生物体内,就能够引起靶标mRNA的沉默,进而进行基因功能研究。在植物、动物学研究中,都取得了广泛的应用。该技术除了用来开发生物农药外,在提高作物产量和性状作物品质方面也发挥了重要作用,已经有多款产品获得上市许可。

RNAi技术在生物医药领域具有非常广阔的应用前景。2018年,Alnylam公司的第一款RNAi药物获批上市,随后几年,陆续有多款产品获批上市,并且也实现了从治疗罕见病到常见病的飞跃。利用RNAi技术开发生物医药,只需要经过简单的″二维序列设计″识别靶标RNA,就能发挥生理功能。因此,RNAi疗法在研发效率、研发成功率、以及可选的靶点范围上,相比于传统的药物,具有很大的优势。

主要参考文献 

[1]Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., and Mello, C. C. (1998). Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 391, 806–811. doi: 10.1038/35888

[2]Palli, S. R. (2014). RNA interference in Colorado potato beetle: steps toward development of dsRNA as a commercial insecticide. Curr. Opin. Insect Sci.6, 1–8. doi: 10.1016/j.cois.2014.09.011

[3]Kolliopoulou, A., and Swevers, L. (2014). Recent progress in RNAi research in Lepidoptera: intracellular machinery, antiviral immune response and prospects for insect pest control. Curr. Opin. Insect Sci. 6, 28–34. doi: 10.1016/j.cois.2014.09.019

[4]Li, J., Wang, X. P., Wang, M. Q., Ma, W. H., and Hua, H. X. (2013b). Advances in the use of the RNA interference technique in Hemiptera. Insect Sci. 20,31–39. doi: 10.1111/j.1744-7917.2012.01550.x

[5]Maktura, G. C., Paranhos, B. J., and Marques-Souza, H. (2021). RNAi in fruit flies (Diptera: Tephritidae): successes and challenges. J. Appl. Entomol. 145, 740–756. doi: 10.1111/jen.12905

[6]Singh, S., Gupta, M., Pandher, S., Kaur, G., Goel, N., Rathore, P., et al. (2019b). RNA sequencing, selection of reference genes and demonstration of feeding RNAi in Thrips tabaci (Lind.) (Thysanoptera: Thripidae). BMC Mol. Biol.20:6. doi: 10.1186/s12867-019-0123-1

[7]Martin, S. E., and Caplen, N. J. (2007). Applications of RNA interference in mammalian systems. Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 8, 81–108. doi:10.1146/annurev.genom.8.080706.092424

[8]Mechanisms, Applications, and Challenges of Insect RNA Interference. doi:10.1146/annurev-ento-011019-025224

[9]RNA-based technologies for insect control in plant production. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2019.107463

[10]Majidiani, S., PourAbad, R. F., Laudani, F., Campolo, O., Zappalà, L., and Rahmani, S. (2019). RNAi in Tuta absoluta management: effects of injection and root delivery of dsRNAs. J. Pest. Sci. 92, 1409–1419. doi: 10.1007/s10340-019-01097-6