来源：《农药》2022年第3期
作者：盛桂林1,张怡1,沈旦军2,段亚冰3,杨文晏4,沈迎春1(1.江苏省农药总站；2.宜兴市植保植检站；3.南京农业大学；4.江阴苏利化学股份有限公司)
桑葚,口感独特,富含花青素、芸香甙等多种微量元素,兼具食、药功能,深受消费者喜爱。在乡村振兴战略背景下,桑葚三产融合发展迅速,桑葚果汁、桑葚酸奶、桑葚果糕、桑葚果醋等深加工产品不断问世,桑葚种植和加工成为扶贫富民产业,全国种植面积逐年扩大,仅四川一个省桑葚产量已经突破4万t,鲜果种植的经济效益达2.5亿元。
由真菌引起的桑葚菌核病,又称桑葚白果病,是桑葚第一大病害,包括肥大性菌核病、小粒性菌核病和缩小性菌核病3种类型,发病率一般为60%,条件适宜年份超过80%,甚至造成绝收。病菌危害桑葚果实,导致桑果发白、异味、失去商品价值,严重制约桑葚产业发展。目前国内无任何农药正式登记用于防治桑葚菌核(http://www.chinapesticide.org.cn/hysj/index.jhtml),生产上多是超范围使用多菌灵、腐霉利等杀菌剂进行防治,且无参考施药量,导致残留超标、环境污染和抗药性等问题频发。本文针对桑葚菌核病病原不明确、药剂防治效果不理想、植物安全性不清楚、农药残留不达标4个问题,研究了桑葚菌核病的发病规律,摸索桑葚菌核病防治中的农药应用技术,为提高防控效率、指导农业生产、保障农产品质量安全提供了技术支撑。
01
材料与方法
1.1 材料
供试药剂：2亿孢子/g小盾壳霉可湿性粉剂(无锡键农生物科技有限公司),3×108CFU/g哈茨木霉菌可湿性粉剂(美国邦沃股份有限公司),50%腐霉利可湿性粉剂(日本住友化学株式会社),70%甲基硫菌灵可湿性粉剂(江苏龙灯化学有限公司),20%嘧菌酯可湿性粉剂、50%啶酰菌胺水分散粒剂(江阴苏利化学股份有限公司),25%吡唑醚菌酯乳油(江苏耘农化工有限公司),乙腈(德国Merck公司),甲酸(SIGMA-ALDRICH公司)。
供试品种：筛选试验,无籽大10；安全性试验,十大、白珍珠、白玉王；啶酰菌胺药效试验,大实(江苏省宜兴市)、红果2号(江西省南昌县)、桂花蜜果桑(四川省青神县)；残留试验,中椹1号(江苏省镇江市丹徒区)、白玉王(河南省济源市)、富士红(湖南省长沙县)、无籽大10(四川省广汉市)。
1.2 试验设计
1.2.1 病原菌的分离鉴定
在江苏省宜兴市、江西省南昌县和四川省青神县试验进行地区采集发病桑葚果实,所有病果单独装袋,用于桑葚菌核病病原菌的分离。病果先用无菌水冲洗,晾干后,用无菌镊子将小核果内的菌核取出备用。用无菌手术刀将菌核从中间切开,并在75%酒精中浸泡消毒1 min,用无菌水漂洗3次,无菌条件下风干。将菌核切面向下置于PDA平板(马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、蒸馏水至1 L、121℃灭菌20 min)上,25℃黑暗条件下培养5～7 d后挑取菌落边缘菌丝转至新的PDA平板上培养,并转接至冻存管进行保存备用。
从培养7 d的PDA平板上刮取适量菌丝,CATB法提取DNA,以引物ITS1/ITS4进行PCR扩增,扩增产物在上海生工生物有限公司进行测序,测序结果在NCBI数据库中进行BLAST比对。
1.2.2 田间药效筛选试验
选用小盾壳霉、哈茨木霉、腐霉利、甲基硫菌灵、嘧菌酯、吡唑醚菌酯和啶酰菌胺7种药剂,每种药剂设2个梯度稀释浓度,另设1个清水空白对照,共15个处理。每个处理小区15株桑树,随机排列,每个处理设3次重复。桑树初花期(5%开花)第1次用药,间隔7 d后第2次施药。桑葚果实转色成熟时调查1次,每个处理定点调查4株树,记录每个处理健康桑果粒数、病果粒数。计算总果粒数、病果率和校正防效。
1.2.3 植物安全性试验
根据农药对农作物安全性评价准则(NY/T 1965.1-2010),选取十大、白玉王和白珍珠3个常见品种为试验对象,将50%啶酰菌胺水分散粒剂用水溶液配制成416.65、833.3、1250、1,666.6 g a.i./hm2的浓度(即田间最高剂量的1、2、3、4倍),以清水作对照处理。将不同品种的果桑苗(每品种2盆)置于喷雾塔内,喷施不同浓度的50%啶酰菌胺水分散粒剂药液(精确喷雾面积为0.2 m2,喷药液10 mL,喷药量为500 L/hm2,喷雾压力为0.5 kPa)。喷药后的果桑苗在自然条件下放置2 h,待叶片上药液风干后移至27℃、相对湿度为50%、12D/12L、光强3,000 lx的人工气候培养室中,试验设4个重复,每2盆果桑作为1次重复。试验喷药前测量供试果桑苗萌发新梢的长度并标记；喷药处理后14 d再测量标记新梢的梢长。用施药后平均新梢长度减去施药前平均新梢长度计算新梢的伸长值。试验期间,每隔2d观察果桑苗生长状态和叶色变化,施药后第14天拍照。
1.2.4 啶酰菌胺农药登记试验
在江苏省宜兴市、江西省南昌县和四川省青神县3地进行试验,每个地区4个重复,50%啶酰菌胺水分散粒剂设置600、800、1,000倍液3个浓度梯度,以20%嘧菌酯可湿性粉剂400倍液为对照,观察防治效果。桑树初花期(5%开花)第1次用药防治,间隔7 d后第2次施药。桑葚果实转色成熟时调查1次,每个处理定点调查4株树,记录每个处理健康桑果粒数、病果粒数。计算总果粒数、病果率和校正防效。
1.2.5 啶酰菌胺在桑葚中残留试验
在江苏省镇江市丹徒区、湖南省长沙县、河南省济源市和四川省广汉市4地试验小区各设置1个处理小区,1个对照小区,每个小区4株桑葚,以制剂量600倍液(有效成分833.3 mg/kg)施药2次,间隔7 d。最后1次施药后的第7天和第14天分别采集成熟的桑葚果实样品,准确称取5 g桑葚于50 mL离心管中,加入25 mL乙腈,研磨振荡30 min,然后以5,000 r/min离心5 min,取0.5 mL上清液加1.5 mL乙腈混溶后,过0.22μm滤膜于1 mL进样瓶中,用液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)法测定残留量(GB 20769-2008)。在毒理学和化学残留量基础上,根据我国居民膳食消费量,估算农药膳食摄入量,包括长期/短期膳食摄入,评估膳食风险。
1.3 数据分析
1.3.1 田间药效筛选试验、啶酰菌胺农药登记试验
式中：PT为处理区病果率,CK为对照区病果率。
相关试验数据采用邓肯氏新复极差“DMRT”法,利用DPS软件进行统计分析。
1.3.2 啶酰菌胺在桑葚中残留量计算
式中：R为样品中测试物残留量(mg/kg),C为样品提取溶液浓度-进样小瓶在仪器中检测出的质量浓度(mg/L),V1为样品溶液的最终定容体积(2 mL,0.5 mL上清液+1.5 mL乙腈),V2为样品溶液的移取体积(0.5 mL),V3为样品提取溶液总体积(25 mL),W为样品质量5 g。
1.3.3 啶酰菌胺在桑葚中的膳食风险评估
计算国家估算每日摄入量：
式中：STMRi为农药在某种食品中的规范残留试验中值(mg/kg)；STMR-Pi为采用加工因子校正后的规范残留试验中值(mg/kg)；Fi为一般人群对该食品的消费量(kg)；b.w.为我国普通人群人均体质量,按63 kg计；RQ为风险商(%)；ADI为农药的每日允许摄入量(mg/kg b.w.)。在计算NEDI时,如果没有合适的STMR值或STMR-Pi值,可直接采用相应的MRL值代替。当RQ≤100%时,认为该农药残留对一般人群健康的影响在可接受的风险水平,值越小,风险越低。
02
结果与分析
2.1 桑葚菌核病的病原菌鉴定
在江苏省宜兴市、江西省南昌县和四川省青神县试验区采集的桑葚菌核病病果上,累计分离获得16株病原菌。ITS序列同源性比对分析结果显示16株病原菌均为核地仗菌(Scleromitrula shiraiana)。形态学鉴定结果表明：在生化培养箱中培养7 d后,气生菌丝发达,菌落表面呈灰色茸毛状,再继续培养7 d后,发现菌落表面呈浅绿色毡状,紧贴培养基生长,菌落边缘不整齐,接近菌落边缘可看到小粒菌核凸起。显微镜观察发现,分生孢子为卵圆形,一侧略尖,符合核地仗菌的形态特征。形态学和分子鉴定结果表明,试验地桑葚菌核病病原均为核地仗菌。
2.2 桑葚菌核病田间药效筛选试验
根据病原鉴定结果,选取对核地仗菌离体活性效果较好的吡唑醚菌酯、嘧菌酯、啶酰菌胺以及桑农常用的甲基硫菌灵和腐霉利,同时增加对子囊菌作用效果较好的盾壳霉和哈茨木霉2种生物农药于2018年在江苏省宜兴市开展田间药效筛选试验。
筛选试验结果表明：7种药剂对桑葚菌核病均有一定防效,各药剂防治后,桑葚菌核病的病果率虽然都出现了下降,但不同药剂的防效存在明显差异。其中吡唑醚菌酯对桑葚菌核病防效优良,防效达到90%；嘧菌酯和啶酰菌胺防效良好,防效在85%以上；3种药剂都能将病果率控制在10%以下。桑农常用的甲基硫菌灵和腐霉利对桑葚菌核病防效中等偏差,其中腐霉利低剂量防效仅为36%；哈茨木霉菌和盾壳霉对桑葚菌核病防效较差,高剂量防效均低于40%,病果率达到30%(见表1)。
2.3 啶酰菌胺对桑葚菌核病的防效
根据江苏省宜兴市田间筛选试验结果,新烟酰胺类杀菌剂啶酰菌胺对桑葚菌核病防效较好,综合考虑防效、登记现状及抗药性等因素,选取啶酰菌胺为代表性药剂,进一步开展田间防效、安全性及残留检测等系列试验。将吡唑醚菌酯和嘧菌酯作为储备药剂,用于后续开发和登记。
为进一步明确啶酰菌胺在不同地区对桑葚菌核病作用效果及防效稳定性,细化使用剂量,根据农药田间试验准则,于2020年在江苏省宜兴市、江西省南昌县和四川省青神县3地桑葚主产区开展了啶酰菌胺防治桑葚菌核病田间试验。试验结果显示：在江苏地区,50%啶酰菌胺水分散粒剂600、800、1,000倍液于初花期施药对桑葚菌核病的防效为88%～95%,在江西地区防效为76%～82%,在四川地区防效为71%～87%,3地防效虽有一定差异,但均高于70%,生产中可有效防控桑葚菌核病(见表2)。另外试验过程中,3地果桑正常生长,未观察到药害症状。
2.4 啶酰菌胺对桑葚的安全性评价
2020年在江苏省句容市开展啶酰菌胺对果桑的安全性试验,结果表明：不同浓度药液喷雾的果桑苗叶色、叶形和株型与空白对照处理果桑苗没有变化,桑葚生长正常。试验同时发现：啶酰菌胺不同浓度药液喷雾后对果桑新梢的伸长均有促进作用,药剂处理组桑苗新梢伸长的长度大于对照处理组,统计分析发现十大和白珍珠2个品种的新梢伸长值显著高于对照处理(见表3)。
2.5 啶酰菌胺在果桑中的残留量
根据残留试验指南要求,在江苏省镇江市丹徒区、河南省济源市、四川省广汉市和湖南省长沙县4地开展了残留试验。参考国标：水果和蔬菜中450种农药及相关化学品残留量的测定(GB 20769-2008)和已报道文献,采用液相色谱-串联质谱法测定残留量。结果表明：啶酰菌胺在末次施药7、14 d后在果桑中的最高残留量分别为7.4、3.5 mg/kg,低于国家标准(GB 2763-2019规定浆果和其他小型水果中啶酰菌胺残留最大值为10 mg/kg),即距离末次施药7、14 d后采摘果桑安全(见表4)。
2.6 啶酰菌胺在果桑中膳食风险
根据我国农药登记和居民的人均膳食结构情况分析,普通人群啶酰菌胺的国家估算每日摄入量是1.30mg,占日允许摄入量的50.38%,膳食风险可接受(见表5)。
03
讨论与结论
桑葚菌核病与小麦赤霉病具有相似性,是桑葚第一大病害,田间药剂防控效果直接决定桑葚的产量和质量。结合病原侵染机制,选择正确的防治时间是保证防治效果的前提。因无正式登记农药,加之部分桑农缺乏防治经验,因此田间防控选择首次施药时具有随意性、盲目性。研究发现,桑葚菌核病花前用药与盛花期用药的防效明显低于初花期用药。田间试验发现,生物农药对桑葚菌核病作用效果较差,可能与生物农药见效慢有关,在初花期喷施,可能在盛花期之后才能见效,导致错过最佳作用时期,生产中如需使用生物农药,建议提前2～4周施用,以确保防效。本试验开展的化学农药田间试验均以初花期(开花量5%)为首次施药时期,防效较好,生产中建议以此为参考。
选择合适药剂是保证防治效果的决定因素。田间筛选试验表明,甲氧基丙烯酸酯类的吡唑醚菌酯、嘧菌酯和烟酰胺类的啶酰菌胺对桑葚菌核病效果较好,符合生产需求。3种药剂均为广谱类高效低毒药剂,且都作用于病原菌线粒体,干扰病原菌能量供应。因啶酰菌胺登记作物种类较多,因此选择啶酰菌胺为代表药剂开展了后续安全性试验、3地田间防效试验和残留试验,且试验效果较好。吡唑醚菌酯和嘧菌酯目前还未在乔木类木本植物上登记,残留和植物安全性试验有待进一步明确,可作为桑葚菌核病防治的技术储备药剂。
生产中常用的苯并咪唑类杀菌剂甲基硫菌灵和二甲酰亚胺类杀菌剂腐霉利对桑葚菌核病防效中等偏差,这与农药作用机制及生产中长期高剂量使用相关。以腐霉利为例,其作用机制是抑制病原菌体内甘油三酯的合成,主要作用于葡萄孢属和核盘菌属真菌,非桑葚菌核病病原核地仗菌的最佳防治药剂。生产中,甲基硫菌灵和腐霉利是最常用、最滥用的杀菌剂,由此引发的病菌抗药性和残留风险居高不下。建议田间防治以啶酰菌胺等药剂替代甲基硫菌灵和腐霉利,以保证桑葚菌核病的田间防治效果。
安全性是农药推广技术的重要指标之一,多数特色作物如菊花、月季对农药较为敏感,常规剂量下易产生药害,这主要决定于植物自身遗传特性和农药作用方式。桑葚属乔木类木本植物,未有相关安全性试验报道。本次安全性试验结果表明,啶酰菌胺对果桑植株具有较高的安全性。此外,啶酰菌胺对果桑新梢伸长具有促进作用,但前期未见相关研究报道,具体促生机制有待进一步研究。
农药残留引发的农产品质量安全是百姓关注的热点话题之一。前期研究发现啶酰菌胺在多种草本植物和葡萄等藤本类木本植物上残留符合国家标准,安全间隔期一般为7 d,但在生菜等极少数特经作物上残留严重超标。目前,未见啶酰菌胺在桑葚等乔木类木本植物上残留试验报道。本试验首次在乔木类木本植物上开展啶酰菌胺的残留试验,江苏、河南、湖南、四川4地样品中啶酰菌胺的残留值及膳食风险均处于可接受范围内,安全间隔期为7 d,为啶酰菌胺登记用于桑葚菌核病的防治提供了安全性支持。另外,试验中4地的残留值有一定差异,江苏为7.2 mg/kg,明显高于其余3地,但仍在国家限量(10 mg/kg)范围内,这可能与桑葚品种、种植环境等多种因素相关。试验结果与啶酰菌胺在南瓜、芦笋和木瓜上的残留结论一致。因此,在生产实践中需严格按照推荐用量施药,盲目提高施药量易引发残留超标。
试验通过系列试验确认了在桑葚初花期(开花量5%)喷施50%啶酰菌胺水分散粒剂600～1,000倍液,间隔7～14 d后第2次施药,对桑葚菌核病防效较好,对桑葚植株安全,药剂施用的为安全间隔期7 d,而且啶酰菌胺在果桑中的残留量符合国家标准,膳食风险可接受。因此,啶酰菌胺可作为生产中防治桑葚菌核病的首选药剂,极具推广价值。轮换用药方面可以考虑吡唑醚菌酯和嘧菌酯,试验结果有待于今后进一步验证。