作者：曾令强、罗睿童、陈琼、郝格非、朱晓磊、杨光富

琥珀酸脱氢酶 (succinate dehydrogenase, SDH)又称为琥珀酸泛醌氧化还原酶 (succinate ubiquinoneoxidoreductase, SQR),其作为一类重要的杀菌剂靶标在农药研究领域扮演着十分重要的角色。琥珀酸脱氢酶抑制剂 (succinate dehydrogenase inhibitor,SDHI) 具有高效、广谱和环境友好等特点。自20世纪60年代第1个商品化SDHI 萎锈灵上市以来,历经60 余年的发展,目前已有24个SDHI 商品化。然而,根据杀菌剂抗性行动委员会 (Fungicides Resistance Action Committee, FRAC)的统计数据显示,已有20多种植物病原菌对SDHI 类杀菌剂表现出抗性,其中16种为田间报道的抗性,而且植物病原菌对现有商品化SDHI 的抗性水平已达到中等甚至高水平抗性。另外,市场上主流的SDHI多为吡唑联苯类,该类化合物由于联苯片段的存在使得其合成成本相对较高,且部分SDHI类杀菌剂对防治植物病害的活性不高,如异丙噻菌胺 虽然对子囊菌等引起的病害具有优异的防治效果,但是对半知菌以及卵菌活性不佳。因此,发现合成成本较低且杀菌谱广的新型SDHI显得尤为重要。

华中师范大学杨光富课题组开发出了″药效团连接碎片虚拟筛选″(pharmacophore-linked frag-ment virtual screening, PFVS) 方法,随后基于此方法成功创制出了新型 SDHI 杀菌剂-氟苯醚酰胺,试验代号：Y13149 (本文中化合物 11,图式 1),中国专利申请号 201310502473.7,国际 PCT/CN2013/089220。生物活性测试结果表明,氟苯醚酰胺对水稻纹枯病和黄瓜白粉病具有卓越的防治效果,同时对小麦白粉病等病菌具有良好的抑制作用。目前该化合物已经转让给企业进行产业化开发。基于此,本文将从PFVS的角度出发,对氟苯醚酰胺的创制过程予以介绍,重点分析其创制过程中的研究思路,以期给农药研究人员创制新农药以启发。

1 药效团连接碎片虚拟筛选

PFVS (图1) 是一种基于分子碎片的药物分子设计方法,该方法克服了传统药物设计方法中必须依赖生物物理技术进行碎片筛选及需要大量高纯蛋白的不足,成功实现了分子碎片的高通量虚拟筛选,使得基于碎片的药物设计方法成为一种更通用的分子设计方法。基于抑制剂与靶标之间的作用机制,PFVS方法的核心思想是在保留抑制剂关键药效团的前提下,对其他部分进行片段合理替换从而生成一个全新的虚拟分子,再结合Amber分子动力学进行能量优化,并对最后构象进行结合自由能计算 (MM/PBSA),挑选打分较高的化合物进行后续研究。该方法的优点是可以合理地、高效率地找到高活性化合物。基于该方法,本课题组已经成功设计并合成了第1个活性达到皮摩尔级别的细胞色素bc1复合物Qo位点抑制剂,该部分内容已有文献做了详细阐述。随后进一步把PFVS方法应用到SDH靶标中进行新型抑制剂的设计,最终获得高活性候选杀菌剂氟苯醚酰胺 (详见下文分析),同时也进一步说明了PFVS方法的普适性较高。

2 氟苯醚酰胺的创制经纬

2.1 现有商品化 SDHI 作用机制研究

药物分子的作用机制是新型药物分子设计的基石。为此,我们选择10个商品化SDHI (图式2),测试了它们对猪心来源的SDH酶水平的生物活性,与此同时,采用分子对接和结合自由能评价方法研究了其结合模式。结果如表1所示,∆Gexp(∆G = −RTlnKi) 与∆Gcal 之间的相关性r2达到0.94,表明结合模式的正确性。

如图2所示,该类化合物中酸部分结构嵌入活性腔中,与C_R46形成阳离子-π相互作用,酰胺键的羰基氧原子与B_W173和D_Y91形成氢键,其胺部分伸向活性腔口处,与C_W35、C_I43、C_I30 形成疏水相互作用。 

2.2 二苯醚片段的发现 

基于上述作用机制,固定吡噻菌胺结构中吡唑酰胺部分,采用PFVS方法对其胺部分进行碎片筛选,获得了8个打分靠前的hit苗头化合物 (图式3)。生物活性测试结果显示,hit4在10μmol/L 浓度下对猪心SCR (SDH 和复合物III 的混合物) 的 IC50值为19.79μmol/L,显示出进一步优化的价值。

2.3 二苯醚片段上取代基的优化

分子模拟结果显示,化合物hit4与靶标的作用方式与商品化SDHI 类似 (图3A),其羰基的氧原子与D_Y91、B_W173 形成氢键相互作用。值得关注的是,相对于已有商品化SDHI的胺部分化学结构 (图式2),hit4中二苯醚片段的柔性较大,末端苯环能够与C_W35 形成 π-π 相互作用。因此拟通过对hit4中末端苯环进行取代基衍生,以期进一步提高该类化合物的生物活性。 

如图4所示,先对二苯醚末端苯环进行修饰获得末端苯环的优势取代基,随后固定末端苯环的优势取代基对吡唑环进行修饰最终获得高活性化合物。化合物的构效关系研究结果 (表2) 表明：当化合物末端苯环2号位上引入单取代基时,其对猪心 SDH的抑制率有着明显的提高,如化合物2(R2=2-Cl),其IC50值达到了 1.98μmol/L,比先导化合物hit4提高了近10 倍；而3号位引入取代基则不利于 SDH抑制活性的提高,如化合物3(R2=3-Cl,IC50=36.9μmol/L)；4号位的构效关系比较复杂,如引入氟原子 (R2=4-F,4) 或者强吸电子基如氰基 (R2=4-CN,6) 时,其SDH抑制活性急剧下降,但是引入氯原子 (R2=4-Cl,5) 时,其IC50值达4.90μmol/L。当末端苯环引入双取代基时,2、4位的修饰对活性的贡献是最显著的,如化合物7(R2=2,4-Cl2),其对SDH的IC50值为2.70μmol/L；而化合物8 (R2=2-Cl-4-CF3) 对SDH的IC50值达0.28μmol/L,是hit4的70倍。 

前期研究工作表明,将吡唑环上的三氟甲基替换为二氟甲基有利于化合物活性的提高。因此,在保留前期所得的优势取代基 (R2=2-Cl-4-CF3等) 的基础上,进一步设计并合成了一系列二氟甲基取代的化合物,并对其进行了生物活性评价,结果 (表2) 和预期一致,即与相应的三氟甲基取代的化合物相比,二氟甲基取代的系列化合物的活性都有了明显提高,大部分化合物对猪心来源的SDH的抑制率要更优于三氟甲基取代的化合物。随后对其进行了活体杀菌活性评价,结果(表3) 表明：这一系列化合物对水稻纹枯病和黄瓜白粉病表现出了优异的防治效果,其中化合物11在12.5mg/L 下对水稻纹枯病仍然保持了95% 的防效,对黄瓜白粉病有 67%的防效,优于对照药剂噻呋酰胺 (水稻纹枯病61%,黄瓜白粉病0%),具有进一步开发的价值。

3 田间药效试验和杀菌谱测试研究

为了进一步研究化合物11对水稻纹枯病的防治效果,委托国家南方农药创制中心浙江基地分别在浙江绍兴市和宁波市两地对其进行水稻纹枯病的田间药效试验。结果如表4所示：5%的化合物11乳油对水稻纹枯病具有较好的防治效果。以浙江宁波为例,按有效成分75.0g/hm2处理,两次施药,第1次与第2次施药间隔期为13d。第2次施药后7d和21d防治效果分别达到了69.6% 和81.2%,优于对照药剂 24% 的噻呋酰胺悬浮剂同剂量处理 (2次施药后7d、21d防治效果分别为48.4%和 75.4%)。同时,在水稻纹枯病初发期施药2次,化合物11的防效持效期能够维持 21d以上,而对照药剂的防效比5%的化合物11乳油有所下降；浙江绍兴的田间药效试验表明,按有效成分75.0g/hm2 处理,5%的化合物11乳油的防效与对照药剂相当。表明化合物11具有良好的市场应用前景。

随后,对化合物11又进行了杀菌谱测试,如图5 所示,化合物11可以用于防治小麦上的众多病害,如小麦白粉病、小麦条锈病、小麦叶锈病、小麦纹枯病、小麦赤霉病、小麦叶枯病等,同时还可以用于防治其他农作物上病害,如油菜菌核病、大豆锈病、花生白绢病、甜瓜白粉病、玉米锈病等。

与此同时,叶片传导试验表明,化合物11还具有良好的向上和向下传导性。需要特别提出的是,从其合成路线 (图式4) 可以看出,合成化合物11的关键中间体为二氟甲基取代的吡唑酰氯和二苯醚,合成成本相对较低,有望在今后农药市场中大放异彩。 

4 化合物11的作用机制研究

生物活性测试结果表明,化合物11对水稻纹枯病和黄瓜白粉病的防治效果优于对照药剂噻呋酰胺 (表3和表4),为了合理解释此现象,我们首先采用同源模建和膜动力学方法获得水稻纹枯病菌 (致病菌为立枯丝核菌R. solani) SDH 的稳定三维结构,随后结合分子对接技术和结合自由计算方法研究了化合物11与不同物种来源的 SDH 作用机制的差异性。分子模拟结果显示,针对不同物种来源的SDH,结合模式的相同点为：化合物11的羰基氧原子与D_Y91和B_W173形成氢键,与 C_R46 形成阳离子-π 作用 (图3B和图3D)。值得关注的是,相对于对照药剂噻呋酰胺 (图3F) 来说,化合物11结构中二苯醚片段的柔性较大,当与水稻纹枯病 SDH 结合时,其二苯醚片段翻转了近180°,从而和D_Y91形成π-π 相互作用,使得其与靶标的作用力增强,提高其生物活性。 

5 结语与展望

通过对10个商品化SDHI类杀菌剂的作用机制进行研究,确定了其结合模式,在此基础上利用 PFVS 方法进行虚拟筛选,得到了8个hit化合物。综合合成难易程度、可修饰性和对SDH抑制率的高低,优先选择了hit4苗头作为先导化合物进行优化。基于作用机制以及前期工作,对吡唑环和二苯醚末端苯环进行取代优化,得到了在酶水平和活体水平上均优于商品化对照药剂噻呋酰胺和吡噻菌胺的化合物11。该创制过程进一步证明了PFVS的广谱性以及该方法在农药创制过程中具有广泛的应用前景。运用该方法,成功获得了具有自主知识产权的新型 SDHI 杀菌剂--氟苯醚酰胺。目前,关于氟苯醚酰胺的抗性风险评估和相关毒理学数据还不够完善,未来将继续补充试验数据以加速其商品化进程。最后,随着我国对新农药创制投入力度的加大,相信未来将有越来越多的具有自主知识产权的优秀的产品在农药市场占据一席之地。