本文通过incoPat科技创新情报平台(IncoPat收录了全球102个国家/组织/地区1亿余件专利信息) 进行数据分析,采用关键词及分类号(蝗虫、蚂蚱、locust、locusts、grasshopper、A01N63、C12N、C12R、A01P7/06、A01P7/04、A01P7/02、A01P7/00)对2000年01月01日至2020年10月15日之间的专利数据进行检索统计。通过全面分析生物方法防治蝗虫的中国专利申请态势、重点申请人状况和专利技术分析,为生物防治蝗虫提供专利信息支撑。

1  中国专利申请态势

图1给出了生物防治蝗虫的申请趋势。可以看出,生物防治蝗虫的专利数量并不是很多,发展也比较晚。2013年以前每年申请的专利数量少于10件,2013年以后申请的数量逐渐增加,但是到2019年每年的申请数量也未能突破30件。申请数量的统计范围是目前已公开的专利。由于时间原因,部分新申请的专利可能还处于未公开的状况,导致(图1)2020年的申请量出现偏低的情况。

图1  生物防治蝗虫专利申请趋势

2  主要申请人的申请量趋势

由图2可以看出,国内申请人主要以高校和研究所为主,其中山西大学是生物防治蝗虫领域申请量最多的申请人,从2000年至今年累计申请量达到42件。排名第二的是中国农业科学院植物保护研究所,申请量达25件,明显高于其余申请人。

图 2  主要申请人的申请量排名

3  国内主要申请人的重点研究方向

3.1  山西大学

由图3可以看出,山西大学在蝗虫生物防治研究方面主要着力与RNAi干扰技术的研究。RNA干扰( RNAi)是一种通常由双链RNA分子引起的特异性转录后基因沉默现象,这一发现不仅为基因的功能研究提供了方法上的突破,同时也为人类的疾病治疗和作物害虫防治开辟了新的途径。山西大学主要研究了通过不同的基因干扰昆虫几丁质、昆虫表皮酯质合成、表皮蛋白等影响抑制蝗虫蜕皮,达到杀死蝗虫的效果。

图3  山西大学防治蝗虫研究方向

3.2  中国农科院植物保护研究所

图4显示中国农科院植保保护研究所在RNAi干扰、真菌防治、通过基因引起免疫抑制反应调节真菌对蝗虫侵染的效果等方面都进行了一定的研究。RNAi干扰技术着力研究相关基因干扰蝗虫的生长发育,通过干扰蝗虫的发育达到防治蝗虫的目的。真菌防治方面,中国农科院植保研究所主要研究了相关蛋白基因增强绿僵菌杀灭蝗虫的效率,绿僵菌及金龟子绿僵菌与相关化药的组合物。中国农科院植保所还通过相关基因导致蝗虫产生免疫的应答达到致死蝗虫的效果。

图4  中国农科院植保所蝗虫研究方向

3.3  四川大学

申请人发现一种杀虫蛋白,该蛋白分子量为25,100 Da。经研究表明,该菌无芽孢,本身具有较强毒蛋白,具有构建成为遗传工程菌广泛用于生物防治的潜力。由图5可知,四川大学在抗杀虫基因技术上做了相关研究。此外,申请人还对真菌及植物来源的活性化合物对蝗虫的防治进行了相关研究。

图5  四川大学蝗虫防治研究方向

3.4  重庆大学

由图6可以看出,重庆大学在RNAi干扰技术和真菌防治蝗虫方面进行了研究。重庆大学研究了ATP合酶α和β亚基基因cDNA 的保守序列,并构建其RNA、DNA等构建体,利用RNAi技术沉默蝗虫体内ATP合酶α亚基,使体内ATP合酶α亚基的表达明显受到抑制,导致蝗虫产生致死效应,可应用于RNAi技术对东亚飞蝗害虫防治。重庆大学还研究了蝗绿僵菌工程菌株的制备,绿僵菌,以及绿僵菌和化学农药的组合物进行蝗虫防治。

图6  重庆大学蝗虫防治研究方向

3.5  中国农业大学

蝗虫微孢子虫是一种蝗虫专性的寄生原生动物,只对蝗虫等直翅目昆虫有致病性,对脊椎动物完全无致病性,在田间使用过程受环境条件的限制较小、生产成低,在防治蝗虫灾害的方面有很强竞争力。由图 7可以看到中国农业大学主要研究方向是蝗虫微孢子在防治蝗虫方面的应用。

图7  中国农业大学蝗虫防治研究方向

4  生物防治蝗虫专利技术分析

通过国内主要申请人生物防治蝗虫的研究方向分析可以看出,我国在蝗虫生物防治方面主要研究方向集中在以下3个方面：(1)RNA干扰技术；(2)真菌防治；(3)蝗虫微孢子。

4.1  RNA干扰技术

RNA干扰(RNAi)是一种由双链RNA分子引起的特异性转录后基因沉默的现象,自2006年获得诺贝尔奖以来,RNAi技术一直跻身于科技前沿。RNAi不仅是研究基因功能的有力工具,同时在害虫防治方面也具有极大潜力。通过RNA干扰进行害虫防治具有如下特点：1)杀虫具有专一性,对非靶标生物无杀伤作用；2)RNA在自然界极易降解,无残留；3)对环境无毒无害,相对安全。因此学者将其称为第四代杀虫剂。基于RNA干扰进行害虫防治的基础技术是筛选靶标序列获得具有高致死作用的dsRNA。广泛用于昆虫RNAi实验的基本方法有两种。一种方法是采用体外合成的dsRNA,然后将其导入昆虫体内或细胞中,称为外源性RNAi；另一种方法是用DNA表达载体导入昆虫体内或细胞中,在体内或细胞中表达时合成dsRNA,称为内源性RNAi。尽管内源性方法可以在昆虫生活史的任何时间实现细胞特异性或组织特异性的RNAi,具有遗传性等优点,但由于很多昆虫还没有建立成功的转基因体系,所以这种方法目前还并不适合许多昆虫的基因功能研究。因此外源性RNAi是目前研究的重点手段。国内申请人研究的方向也主要是通过筛选基因序列合成相关的dsRNA,然后将其导入昆虫体内或细胞中进行防治蝗虫研究。

4.2  真菌防治

昆虫病原真菌是昆虫病原生物中的最大类群。据野外调查越冬昆虫发现,昆虫疾病中约有60%是由真菌引起的,病原真菌也是最早被系统地利用来控制害虫的昆虫病原微生物。

蝗虫的主要病原真菌,包括绿僵菌 M. anisopliae、白僵菌 B. bassiana、黄绿僵菌 M. flavoviride、黄曲霉菌 Aspergillus flavus 等。我国申请人中国农业科学院植物保护研究所、重庆大学、四川大学、中科院动物研究所、江西天人生态股份有限公司等都对绿僵菌、白僵菌进行了相关研究,也有对蛋白或化学农药与绿僵菌或白僵菌组合来提高相应真菌的杀虫效果的研究。

白僵菌是一种半知菌类的虫生真菌,可以侵入6个目15科200多种昆虫、螨类的虫体内大量繁殖,同时不断产生白僵素(大环脂类毒素)和草酸钙结晶,这些物质可引起昆虫中毒,使体液发现机能发生变化,打乱新陈代谢以致死亡。金龟子绿僵菌属于半知菌亚门绿僵菌属,是一种广谱的昆虫病原真菌,可寄生于多种昆虫体内。绿僵菌具有显著的杀虫效果,并且具有不同于现有杀虫剂的全新的作用机理,主要作用于昆虫血淋巴免疫系统,使之丧失免疫防御功能。白僵菌和绿僵菌制剂对人、畜无毒,对作物安全,无残留、无污染,但能感染家蚕幼虫,形成僵蚕病。因此,白僵菌和绿僵菌制剂防治蝗虫具有较强的优势。

4.3  蝗虫微孢子

蝗虫微孢子 Nosema(Paranosema)locustae是一种可以侵染100多种直翅目昆虫的单细胞真核病原微生物,其在田间的应用范围非常广泛。蝗虫取食了被蝗虫微孢子污染过的食物后,孢子即在蝗虫消化道中萌发,暴发性地突出极丝尖端,穿进寄主细胞和中肠肠壁细胞,到达血腔,进入感受性组织细胞如在脂肪体中开始无性裂殖生殖,将孢子的孢原质释放出来,开始在寄主的细胞内大量繁殖,消耗蝗虫体内的能源物质,导致虫体总脂含量和血淋巴甘油脂含量大幅度下降及血淋巴脂肪酶活力大幅度上升,使蝗虫出现畸形,发育期延长,寿命缩短,丧失生殖能力。此外,微孢子还可侵染蝗虫的唾腺、围心细胞及神经组织；在其病虫体内的卵细胞、侧输卵管、中输卵管中均发现有微孢子,产卵量下降约50%,孵化率极低,取食量下降,随着微孢子在寄主体内不断增殖,使寄主的生理机能等遭到破坏而死亡。蝗虫微孢子不污染环境、不杀伤天敌、对人畜安全,不产生对其他生物的二次毒害,有利于保护生物多样性。中国农业大学针对蝗虫微孢子虫的致病力一般较弱的缺陷,从田间患病的东亚飞蝗中分离筛选得到蝗虫微孢子虫(Antonospora locustae),命名为AL2008L-04株系,结果表明,AL2008-01株系具有良好的致病力,提高蝗虫微孢子虫的毒力。

5  结语

通过专利数据统计和技术分析可以看出,我国生物防治蝗虫的研发主体集中在高校和研究所,研究的重点在使用RNA干扰技术。RNA干扰技术具有杀虫具有专一性,对非靶标生物无杀伤作用；RNA在自然界极易降解,无残留；对环境无毒无害,相对安全等优点。其研究的机理是通过选择合适的基因序列然后在体外合成的dsRNA,将合成的dsRNA 在注入蝗虫体内。这样的方法在农业领域大规模防治蝗虫上存在施用困难的缺点。因此,研发适用大规模防治蝗虫的RNA干扰技术是未来发展的方向。

昆虫病原真菌,相较于化学杀虫剂,具有环境友好、抗逆性强、能大量扩散、选择性高等优点,是广泛应用的一类生物农药。然而,目前昆虫病原真菌作为杀虫剂仍然存在着致死时间较长的缺点。通过研究真菌致病机理,利用基因工程手段改造真菌,提高真菌杀虫剂的效果是当前研究的一个重要方向。

蝗虫微孢子虫是一种蝗虫专性的寄生原生动物,只对蝗虫等直翅目昆虫有致病性,对脊椎动物完全无致病性,实验研究证明对蜜蜂也不感染,安全性好,而且该病原物在田间使用过程受环境条件的限制较小、生产成低,因此在防治蝗虫灾害的方面有很强竞争力。克服当前蝗虫微孢子虫的致病力一般较弱的缺陷,筛选合适的蝗虫微孢子虫提高蝗虫微孢子虫的毒力是该领域值得关注的研发方向。